However, previous studies by French researchers had shown that, in acetylcholinesterase, amino acid substitution mutations contributing to resistance occur at only a very limited number of sites, and that an allele carrying resistance-type mutations at three of these sites is one of the most widely distributed resistance alleles worldwide. Therefore, for a part-time researcher in a limited and dependent position like myself who needed to keep costs as low as possible, the most realistic strategy was to focus, as a first step, on examining the DNA sequences corresponding to these three amino acid sites. In this situation, allele-specific PCR was the most appropriate method, and it was exactly the experimental approach I had been planning while I was in Edinburgh, after ordering a PCR textbook from Japan and studying it before returning. With this method, most of the necessary equipment was already available in the laboratory where I was working, and I was able to carry out the experiments at little cost, essentially limited to consumables such as PCR tubes and pipette tips. However, I had no idea how to actually prepare DNA samples or how to use laboratory equipment such as a PCR thermal cycler, so I decided to ask the graduate student who had identified the acetylcholinesterase mutations to teach me. Although she had already graduated and was working full time, she kindly came all the way to Tsukuba on her day off, and I was able to learn directly from her as she demonstrated the procedures right in front of me.
(translated version of the post on November 01, 2021)
ただ、そうはいうものの、アセチルコリンエステラーゼの場合、フランスの研究者たちが報告していたように、抵抗性に寄与するアミノ酸置換突然変異は極めて限定的なアミノ酸サイトで起こっており、そのなかでも、3つのアミノ酸サイトにおいて抵抗性型の変異を有している対立遺伝子が、世界中にもっとも拡散している抵抗性型の対立遺伝子の1つであることが示されていたので、このような、非常勤研究員という居候身分が、できるだけコストをかけないで実験するとすれば、この3つのアミノ酸サイトの塩基配列だけをとりあえず調べていくという戦略が、最も現実的な戦略だったのだろうと思います。それには対立遺伝子特異的PCR法が適切であり、それは、エジンバラから日本に帰国するまでの間に、日本からPCR法のテキストを取り寄せて、エジンバラにおいて構想を練っていた実験方法でもありました。この方法であれば、お世話になっていた研究室に、必要なものはほとんどありましたし、PCR用のチューブやピペッターのチップなどの消耗品ぐらいのコストでなんとか実験できることになります。ただ、実際にサンプルとなるDNAをどのように調整し、PCRのサーマルサイクラーのような実験器具をどのように使えばいいのかはわからなかったので、実際に、アセチルコリンエステラーゼの変異を検出した大学院生に教えてもらうことになりました。彼女はもうすでに大学院を卒業して就職していたのですが、休みの日にわざわざ筑波まで来てもらって、実際に、目の前で実演してもらいながら教えてもらうことができました。
(2021年11月1日のポストを再掲）