Here, I would like to briefly explain the technique known as allele-specific PCR. Allele-specific PCR involves designing primers that are specific to either resistant or susceptible acetylcholinesterase alleles. When PCR is performed using a primer designed to detect a resistance-associated point mutation, amplification occurs if the resistant allele is present, whereas no amplification occurs if only the susceptible allele is present. Conversely, when PCR is performed using a primer designed to detect a susceptible allele, amplification does not occur if only the resistant allele is present, whereas amplification occurs if the susceptible allele is present. Therefore, for example, if a DNA sample is obtained from an individual that is homozygous for the resistant allele at each mutation site, amplification will be observed with primers specific to the resistant allele but not with primers specific to the susceptible allele. In contrast, in a sample from an individual that is homozygous for the susceptible allele, amplification will not occur with primers specific to the resistant allele but will occur with primers specific to the susceptible allele. By contrast, in a sample from a heterozygous individual carrying both resistant and susceptible alleles, PCR amplification will occur with both primers. In this way, the presence or absence of PCR amplification indicates whether a point mutation is present in the allele, and this can be determined from an electrophoretic gel image of the PCR products. In other words, by performing PCR on a single sample using two types of primers—one specific to the resistant allele and the other specific to the susceptible allele—and subsequently obtaining an electrophoretic gel image of the PCR products, it is possible to determine the genotype of each individual. I therefore considered that this approach would allow relatively easy and cost-effective analysis of, for example, the fluctuation of variation in acetylcholinesterase alleles within a population. However, this method is feasible largely because acetylcholinesterase is a genetic factor whose resistance-associated mutations have been extensively studied at the molecular genetic level and whose characteristics have been described in considerable detail. It is not necessarily a method that can be applied universally. In that sense, I feel fortunate to have been able to draw upon such well-established and useful information for the gene that became the focus of my research.
(translated version of the post on November 02, 2021)
ここで、対立遺伝子特異的PCR法という手法を、簡単に説明させてもらいたいと思います。対立遺伝子特異的PCR法というのは、例えば、抵抗性型と感受性型のアセチルコリンエステラーゼの対立遺伝子それぞれに特異的なプライマーを適切に設計することによって、抵抗性型の点突然変異検出用のプライマーでPCRを行った場合には、もし抵抗性型の点突然変異が存在していれば、PCRによるDNAの増幅が起こりますが、感受性型の対立遺伝子しか存在しない場合には、PCRによるDNAの増幅は起こらないことになります。逆に、感受性型の対立遺伝子検出用のプライマーでPCRを行った場合には、抵抗性型の点突然変異のみが存在する場合には、DNAの増幅は起こりませんが、感受性型の対立遺伝子が存在する場合には、PCRによるDNAの増幅が起こることになります。なので、例えば、それぞれのサイトにおいて、抵抗性型の点突然変異をホモ接合の状態で保持している個体のDNAをサンプルとした場合には、抵抗性型用のプライマーでPCRを行ったときには増幅が起こりますが、感受性型用のプライマーでは増幅が起こらないことになります。逆に、感受性対立遺伝子をホモ接合の状態で保有している個体のサンプルでは、抵抗性型のプライマーでは増幅が起こりませんが、感受性用のプライマーでは増幅が起こることになります。一方、抵抗性型の対立遺伝子と感受性型の対立遺伝子をヘテロ接合の状態で保有している個体のサンプルでは、両方のプライマーでPCRによる増幅が起こることになります。このように、PCRによる増幅が起こったか否かによって、保有している対立遺伝子に点突然変異が起こっているか否かがわかり、それはPCR産物の電気泳動の写真などから判別することができるわけです。つまり、1つのサンプルについて、抵抗性型と感受性型の2種類のプライマーそれぞれについてPCRをおこない、PCR産物の電気泳動の写真から、個体の遺伝子型を判別することができることになり、例えば、集団内におけるアセチルコリンエステラーゼの変異の変動などを、比較的容易に、かつ安価に決定することが可能になるのではないかと考えました。ただこれはあくまでも、アセチルコリンエステラーゼという、殺虫剤抵抗性に寄与している変異が分子遺伝学的にとてもよく研究されており、その特質が極めて明確に報告されている遺伝子だからこそ可能であった方法であると言えるのではないかと思います。必ずしも一般的に用いることができる方法ではないのかもしれません。そういった意味で、研究の焦点となっている遺伝子について、参考にすることができる情報を手に入れることができたのは、ラッキーだったと思います。
(2021年11月2日のポストを再掲）