Some notes on allele-specific PCR
There are several points to keep in mind when using the allele-specific PCR method, which I briefly note here. In standard allele-specific PCR, the terminal nucleotide at the 3′ end of the primer is designed to either match or mismatch the target point mutation. When the terminal base is perfectly matched, DNA extension proceeds, leading to successful PCR amplification. In contrast, when a mismatch is present at the 3′ end, DNA extension is inhibited and no subsequent amplification occurs. However, even when a primer terminates in a mismatch, DNA polymerase may fail to discriminate the mismatch, allowing DNA extension to proceed. Indeed, it has been reported that introducing an additional mismatch into the primer to enhance allele specificity can dramatically increase the specificity of allele-specific primers (Pettersson et al., 2003). Based on these reports, I also conducted preliminary experiments and found that primers containing only a single mismatch at the 3′ end did not exhibit sufficient allele specificity in some cases; that is, DNA amplification occurred with both primers. In contrast, the introduction of an additional mismatch at the 3′ end (i.e., two consecutive mismatches) improved allele specificity in these cases. Accordingly, based on the results of these preliminary experiments, additional mismatches were incorporated into the 3′ end of primers when necessary.
(translated version of the post on November 02, 2021)
対立遺伝子特異的PCRで注意したこと
この対立遺伝子特異的PCR法について、注意すべきポイントがいくつかあるので、ここで付け加えておきたいと思います。通常の対立遺伝子特異的プライマーの場合には、プライマーの最後、3’末端側の塩基が、検出されるべき点突然変異とマッチするか、あるいはミスマッチするように設計されています。つまり、最後の塩基のところでマッチしていれば、それに続いてDNAの伸長がおこり、PCRによる増幅がおこることになりますが、ミスマッチの場合にはDNAの伸長がそこでストップしてしまい、DNAの増幅はおこらないということが想定されています。しかし、たとえプライマーの最後がミスマッチで終わっていたとしても、DNAポリメラーゼがミスマッチとして認識することができずに、そのままDNAの伸長がおこってしまうことがよくあるとのことでした。実際、対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異性を高めるために、さらなる付加的なミスマッチをプライマーに加えると、それによってプライマーの対立遺伝子特異性が劇的にアップするという報告がありました（Pettersson et al., 2003）。これらの報告を参考にして、私も予備実験を行ったところ、3’末端に1つしかミスマッチのないプライマーでは対立遺伝子の特異性がみられず（つまり、両方のプライマーでDNAの増幅がおこってしまった）、3’末端にさらにミスマッチを加える（つまり、ミスマッチを2つ連続させる）と、対立遺伝子特異性が向上する場合があったので、予備実験の結果に基づいて、さらなるミスマッチをプライマーの3’末端に付加する場合もありました。
(2021年11月2日のポストを再掲）