Nevertheless, the results differed from what I had originally expected, and various difficulties arose with the method I had been using up to that point. Originally, the allele-specific PCR method had been developed under the assumption that there was a single type of resistant allele (namely, the one carried by the resistant lines analyzed by the graduate student) along with a susceptible-type allele. However, when multiple alleles exist, as in this case, it becomes difficult to determine the allele type in individuals that are heterozygous for resistance-associated point mutations at multiple sites. If there were only two alleles, as originally assumed, there should have been no difficulty in interpreting the results of allele-specific PCR. For example, if an individual has the genotype R/S–R/S–R/S at three amino acid sites (where R denotes a resistance-associated variant and S a susceptible variant), and if only the two originally assumed alleles exist in the population, then that individual would carry two alleles: R–R–R and S–S–S. However, if multiple alleles exist in a population, it becomes difficult to determine from allele-specific PCR genotypes whether an individual carries the R–R–R and S–S–S alleles, the R–S–R and S–R–S alleles, or the R–R–S and S–S–R alleles, and so on.
(translated version of the post on November 06, 2021)
そうはいうものの、当初想定していたこととは異なる結果だったわけですから、これまでに用いてきた方法にも、いろいろと困難がでてきました。もともと、対立遺伝子特異的PCR法は、抵抗性型の対立遺伝子が1種類（大学院生が解析した抵抗性系統が持っていたもの）、感受性型の対立遺伝子が1種類であるという想定のもとで考えられてきましたが、このように複数の対立遺伝子が存在することになると、複数のサイトにおいてヘテロ接合の状態で抵抗性型の点突然変異をもつ個体の場合、対立遺伝子のタイプを決定することができなくなってしまいます。当初想定していたように、対立遺伝子が2種類しかない場合であれば、対立遺伝子特異的PCRの結果を解釈することには困難はないはずでした。例えば、3つのアミノ酸サイトについて、ある個体がR/S-R/S-R/Sという遺伝子型をもっているとすると（Rは抵抗性型の変異、Sは感受性型の変異）、もともと想定されていた2種類の対立遺伝子しか集団になければ、その個体は、R-R-RとS-S-Sという2種類の対立遺伝子を持っていることがわかります。しかし集団中に複数の対立遺伝子が存在しているならば、その個体が、R-R-RとS-S-Sの対立遺伝子を持っているのか、R-S-RとS-R-Sの対立遺伝子を持っているのか、あるいは、R-R-SとS-S-Rの対立遺伝子を持っているのか、などといったことは、対立遺伝子特異的PCRによって決定された遺伝子型からは判別することはできなくなってしまいます。
(2021年11月6日のポストを再掲）