Confirmation by direct sequencing
On the other hand, if an individual is homozygous for point mutations at each of these three sites, the genotype can be interpreted as representing a single allele, at least with respect to these sites. Therefore, I used a method known as direct sequencing to examine DNA sequences from individuals identified as homozygous at these sites by allele-specific PCR. This was done to confirm that these alleles had not been misidentified by allele-specific PCR and that previously unanticipated resistance alleles were indeed present in the Katsunuma population newly collected in 2006. I used the primers that the graduate student had employed to determine partial DNA sequences of acetylcholinesterase to amplify the DNA region containing these three amino acid sites, and I then outsourced the sequencing to a commercial company. Incidentally, the graduate student determined the DNA sequences of the template strand of genomic DNA, which I believe was a very wise decision, since the template strand is the one actually transcribed in vivo. In addition, because this study involved direct sequencing rather than allele-specific PCR, a high-fidelity DNA polymerase with exonuclease activity was used for PCR amplification. Furthermore, in some cases, additional mismatches had been intentionally introduced into the primers used for allele-specific PCR to enhance allele specificity. Therefore, examining the DNA sequences obtained by direct sequencing made it possible to confirm whether allele-specific PCR had indeed detected the expected point mutations.
(translated vesion of the post on November 07, 2021)
ダイレクト・シークエンシングによる確認
一方、これらの3つのサイトにおいて、変異をそれぞれホモ接合の形で保有している遺伝子型ならば、少なくともこれらのサイトに関する限り1通りの対立遺伝子として決定することができるので、PCRによってこれらのサイトでホモ接合であると判定された個体のDNAサンプルを使って、ダイレクト・シークエンシングという分析方法を用いて、DNAの塩基配列を調べてみました。これらの対立遺伝子が、対立遺伝子特異的PCRによる誤った判別などというものではなく、もともと想定されていなかったような抵抗性型の対立遺伝子が、2006年に新たに採集された勝沼集団に実際に存在していたことを確認するためです。大学院生がアセチルコリンエステラーゼの部分的な塩基配列を決定するときに用いたプライマーを用いて増幅した、これら3つのアミノ酸サイトを含むDNA領域のPCR産物をもとに、業者に委託して塩基配列を決定してもらいました。ちなみに、この大学院生は、ゲノムDNAの鋳型鎖になるほうの塩基配列を決定してくれていましたが、ゲノムDNAにおいて実際に機能しているのは鋳型鎖なわけですから、とても賢明な配慮だったように思います。また、今回は対立遺伝子特異的PCRではなくシークエンシング（塩基配列の決定）だったので、DNAポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ活性を有する、より精度の高いPCR用の酵素を用いました。さらに、対立遺伝子特異的PCRに用いたプライマーには、対立遺伝子特異性を高めるために、付加的なミスマッチをあえて追加していた場合もあったので、ダイレクト・シークエンシングによって決定された塩基配列を調べることによって、対立遺伝子特異的PCRが期待された点突然変異を実際に検出していたかどうかを確認することにもなります。
(2021年11月7日のポストを再掲）