As mentioned briefly earlier, the Katsunuma population newly collected in 2006 contained considerably high frequencies of resistance-associated point mutations at the three amino acid sites in acetylcholinesterase. In fact, because the flies were collected during the peak of midsummer, it appeared that selection pressure from insecticides applied in grape cultivation had been strong, and virtually no individuals died at the insecticide concentration used in the assay. In this analysis, I aimed to examine the contribution of point mutations to survival or mortality. Therefore, if no individuals died, it would be impossible to determine whether these mutations actually influenced survival outcomes. In other words, analyses conducted in a population consisting only of surviving individuals would not allow a reliable assessment of the effects of these mutations, and any results obtained under such conditions would likely be strongly biased. Careful interpretation would therefore be required when discussing such findings. In fact, in addition to acetylcholinesterase, at least one resistance factor on the second chromosome is also present in the Katsunuma population. Therefore, to investigate whether the presence or absence of each resistance-associated point mutation at the three amino acid sites in acetylcholinesterase is actually related to survival or mortality at a single concentration of an organophosphate insecticide, information on the genotypes of dead individuals was also necessary. For this reason, I also conducted bioassays using individuals from an isofemale line derived from a female collected in Katsunuma during my graduate studies and subsequently established as an organophosphate-susceptible line. DNA was extracted from dead individuals, and their genotypes were determined using allele-specific PCR. I then performed regression analyses relating individual survival or mortality to the allele-specific PCR results for the presence or absence of resistance-associated point mutations at the three amino acid sites. These analyses provided insight into the contribution of resistance-associated point mutations at these key sites in acetylcholinesterase to organophosphate resistance.
(translated version of the post on November 08, 2021)
先ほども軽く触れましたが、2006年に新たに採集された勝沼の集団には、アセチルコリンエステラーゼの3つのアミノ酸サイトにおいて、抵抗性型の点突然変異が少なからず存在していました。実際、採集したのが真夏の暑い盛りだったこともあり、ブドウの栽培過程で散布された殺虫剤による選択圧がかかっていたようで、この集団の個体は検定に用いた殺虫剤濃度のもとでは、実質的にほとんど死亡することはありませんでした。ここでの分析では、点突然変異の生存あるいは死亡への寄与を調べようとしていたわけですから、死亡する個体がいてくれなければ、生存あるいは死亡に点突然変異が実際に寄与しているかどうかを判別することはできません。つまり、生存している個体しかいない状況で変異を調べても、その変異が実際に生死に関与していると判断することはできないでしょうし、何らかの結果が得られたとしても、かなりバイアスがかかった結果であるため、注意が必要になるのだろうと思います。実際、勝沼には、アセチルコリンエステラーゼの他に、少なくとも第2染色体上の抵抗性遺伝子も存在していますから、アセチルコリンエステラーゼの3つのアミノ酸サイトにおいて検出されたそれぞれの抵抗性型の点突然変異の有無が、実際に有機リン剤の1濃度のもとでの生死に関わっているのかを調べるには、死亡個体の遺伝子型の情報も必要になってくるのだろうと思います。というわけで、私が大学院生のときに勝沼で採集し、有機リン剤に対する感受性の系統として確立された1雌由来系統の個体を用いて殺虫試験を行い、死亡個体からもDNAを抽出して、その遺伝子型を対立遺伝子特異的PCRによってテストしてみました。これらの、個体レベルでの生死の結果と、3つのアミノ酸サイトにおける抵抗性型の点突然変異の有無に関する対立遺伝子特異的PCRの結果について回帰分析をおこない、アセチルコリンエステラーゼにおいて特に重要とされた3つのアミノ酸サイトにおける抵抗性型の点突然変異の、有機リン剤抵抗性への寄与に関する洞察を得ました。
(2021年11月8日のポストを再掲）